Um laboratório secreto localizado próximo ao Círculo Polar Ártico é roubado por um veículo misterioso usando um ímã gigante. A AVL, Anti-Villain League (Liga Anti-Vilões) desconfia da ação, pois o laboratório continha um composto químico mutante, PX-41, que transforma seres vivos em máquinas de matar indestrutíveis. A organização decide recrutar Gru, um ex-vilão, para ajudar a AVL a impedir que o composto químico caia em mãos erradas. Enquanto isso, Gru está na sua casa, na festa de aniversário de sua filha, Agnes. Gru liga para a fada que havia convidado para animar a festa, no entanto, ela anuncia que não viria, forçando Gru a se vestir como uma fada para não decepcionar Agnes. Após o show, Agnes admite a Gru que sabia que tinha se vestido de fada, porém fingiu que não sabia pra que seus colegas não descobrissem a farsa.
Após a festa de aniversário, Lucy Wilde, uma agente da AVL, sequestra Gru de uma maneira forçada, após atordoa-lo usando um laser disfarçado de batom. Dois dos Minions de Gru que tentaram impedir o sequestro também são capturados. Eles viajam para a sede subaquática da AVL, onde Gru encontra-se com o diretor da organização, Silas Bundovski. Ele pede a Gru para ajudar a AVL em seus esforços para rastrear o autor do roubo do laboratório e o composto procurado. Porém Gru se recusa a ajudà-los, preferindo concentrar-se em seu novo empreendimento de produção de geleias engarrafadas e na responsabilidade de ser pai de suas três filhas adotadas, Margo, Edith e Agnes. Antes que Gru saia, Lucy admite que ficou impressionada com o seu trabalho como vilão e lhe dá seu cartão de visita para ele, pedindo-lhe para entrar em contato com ela, se ele mudasse de idéia. Ao voltar para seu laboratório, Gru percebe que sua linha de produção feita por seus Minions está produzindo garrafas de geleias com um gosto horrível. Além disso, o seu cientista, Dr. Nefario, confessa a Gru que ele sente falta de ser "mal" e que lhe foi oferecido um emprego em outro lugar. Após uma salva de 21 "puns" atirados com armas pelos Minions em homenagem ao Dr. Nefario (que na verdade foram 22), Gru entra em contato com Lucy e assume a tarefa de recuperar o composto roubado.
Traços do aroma químico do composto levam os agentes a fazerem uma busca nos confins do Paradise Shopping. Gru e Lucy começam a trabalhar disfarçados como proprietários de uma loja de cupcakes. Gru começa a suspeitar de um proprietário de restaurante no shopping, chamado Eduardo, e desconfia que ele seja um ex-vilão chamado El Macho, que supostamente suicidou-se ao explodir um vulcão ativo com uma bomba presa a um foguete de tubarão. Lucy e Gru decidem entrar no restaurante discretamente durante a noite, mas são vistos pelo frango de estimação de Eduardo e escapam de ser vistos por Eduardo quando ele retorna à sua loja no final da noite. No entanto, eles só encontram apenas uma receita secreta de salsa em um pote em seu cofre, e nada que seja relevante para ligar Eduardo ao roubo do composto. Enquanto os agentes investigam o vendedor de perucas Floyd Cabeça-de-Águia, uma das filhas de Gru, Margo, começa a desenvolver uma paixão pelo filho de Eduardo, Antonio, para a frustração de Gru. Enquanto isso, Eduardo convida a família de Gru para a festa de Cinco de Mayo em sua mansão, e seu instinto de proteção familiar leva Gru a fazer acusações infundadas a Silas sobre Eduardo e seu filho, prejudicando sua credibilidade.
Mais tarde naquele dia, uma vizinha de Gru, Jillian, coloca Gru em um encontro com sua amiga rude e superficial, Shannon. Durante o encontro, Shannon descobre que Gru estava usando uma peruca e ameaça humilhá-lo em meio aos outros clientes que estavam presentes no restaurante, mas Lucy chega ao local, atirando um dardo tranquilizante em Shannon, fazendo ela desmaiar. Eles levam Shannon desmaiada para casa, e Gru percebe que ele está apaixonado por Lucy. Ao retornar ao shopping no dia seguinte, Gru descobre que os agentes da AVL prenderam Floyd Cabeça-de-Águia, após a equipe ter descoberto um frasco vazio que continha vestígios do composto PX-41 em sua loja. Silas diz a Gru que o caso está encerrado e que Lucy irá ser transferida para a Austrália. Antes de ir embora, Lucy lhe dá o seu taser-batom, como uma lembrança do tempo em que trabalharam juntos. Inconsolável, Gru volta para casa, e diz a Agnes que ela estava certa de que ele ama Lucy. No entanto, Gru não foi capaz de tomar coragem para ligar para Lucy antes que ela fosse embora, chegando até a incendiar propositalmente o seu telefone. Gru e suas filhas vão para a festa de Eduardo, e Gru segue Eduardo até o seu porão secreto, e descobre que ele era realmente o vilão El Macho, que supostamente estava morto. Além disso, ele descobriu também que o Dr. Nefario estava trabalhando para Eduardo e que os dois sequestraram alguns de seus Minions para criar um exército do mal com Minions geneticamente modificados com o composto químico PX-41 (transformando os em monstros de pêlos roxos). Eduardo oferece a Gru a chance de se juntar a ele para conquistar o mundo, porém Gru recusa a proposta oferecendo-lhe desculpas pouco convincentes e rapidamente sai com as suas filhas. Margo conta a Gru que havia terminado com Antonio, enquanto este havia se interessado por outra garota. Após isso, Gru atira em Antonio com seu raio de congelamento, transformando ele em um bloco de gelo.
Enquanto isso, Lucy, já dentro de um avião com destino a Austrália, começa a ver o rosto de Gru em tudo que vê, e acaba percebendo que está apaixonada por Gru. Lucy então salta do avião e começa a voar em um asa-delta montado em sua bolsa, e voa para a mansão de Eduardo. Após chegar a festa (curiosamente no exato momento em que Gru vai embora de carro com suas filhas), Eduardo descobre que Lucy é uma agente disfarçada da AVL após seu frango de estimação pegar o seu crachá de identificação em sua bolsa, e rapidamente prende-a. Gru recebe uma mensagem de vídeo do Dr. Nefario lhe dizendo que Lucy havia sido capturada por Eduardo. Após isso, Gru, acompanhado de dois Minions, segue para a mansão de Eduardo, enquanto um Minion geneticamente modificado parte para a sua casa e ataca suas filhas. Ao chegar na mansão, Gru disfarça os Minions com uma geléia roxa de bolo, e finge-se de prisioneiro deles. Porém, o disfarce dá errado, e Gru e seus Minions começam a ser atacados pelos Minions modificados. As filhas de Gru conseguem ser salvas pelo Dr. Nefario, que atira um antídoto do composto PX-41 no Minion que as atacava, fazendo ele voltar ao normal. Após isso, o Dr. Nefario mistura o antidoto do PX-41 com as geleias de péssima degustação, e após isso ele e as filhas de Gru partem para a mansão de Eduardo. Ao chegar lá, eles começam a atirar no Minions modificados, fazendo eles voltarem ao normal e pararem de atacar Gru. No entanto, Eduardo (agora caracterizado como El Macho) toma o que sobrou do composto PX-41, e se transforma em um monstro gigante. Gru derrota El Macho após usar o batom-taser de Lucy, e termina de "curar" os Minions com o restante do antídoto do PX-41.
Gru parte para soltar Lucy, que está amarrada a um foguete de tubarão. No entanto, o frango de estimação de Eduardo ativa o foguete ao bicar o botão do controle de acionamento, e os dois são lançados em direção ao vulcão onde El Macho forjou sua morte. Gru consegue soltar Lucy, e antes de pularem do foguete no oceano, Gru rapidamente convida Lucy para um encontro, que é aceito por ela. Os dois saltam no oceano pouco segundos antes do foguete atingir e explodir o vulcão. 147 encontros depois, Gru e Lucy se casam, e Margo, Edith e Agnes finalmente ganham uma mãe. Após a cerimônia de casamento, os Minions encerram o filme fazendo uma performance das músicas "I Swear" (propositalmente cantada como "Underwear") e "Y.M.C.A.", enquanto os convidados dançam. No entanto, durante a cena final do filme, um Minion geneticamente modificado surge, surpreendendo a todos. Durante os créditos finais, os Minions fazem um anúncio do filme Minions, que estreará em 2015, porém, eles são constantemente impedidos pelos créditos.
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